1. 标本的采集与保存

在生物医学检测中，ELISA（酶联免疫吸附测定）可用多种标本进行分析，包括体液（如血清）、分泌物（如唾液）、以及排泄物（如尿液和粪便）。这些标本可以用来检测特定的抗体或抗原成分。有些标本可直接进行测试（如血清和尿液），而另一些则需经过预处理（如粪便和部分分泌物）。在大多数ELISA检测中，血清是最常使用的标本。血浆中的成分与血清相似，但血浆中仍包含纤维蛋白原和抗凝剂，因此制备血浆标本需使用抗凝剂，而血清则可通过自然凝固获得。

2. 检测标本的注意事项

在医学检验中，血清通常作为检测标本，ELISA中也可同样应用血浆。在血清采集时，要注意避免溶血，因为红血球的溶解会释放出具有过氧化物酶活性的物质，这可能导致通过HRP标记的ELISA检测出现非特异性的显色反应。最好在新鲜样本上进行检测。如样本受到细菌污染，菌体可能会含有内源性HRP，从而引发假阳性反应。为了避免色差，血清标本应在4℃下保存，通常在5天内检测。超过一周的样本则需低温冰存。对于需要多次检测的血清，建议分装存储，并进行无菌操作，必要时可加入适量防腐剂。

3. 试剂的准备

根据试剂盒说明书的要求，准备实验中所需的试剂。在ELISA中使用的蒸馏水或去离子水应确保新鲜且质量高。自行配置的缓冲液需用pH计确认其准确性。实验用试剂应在使用前使其温度与室温平衡，未用的试剂应及时放回冰箱保存，以保持其有效性。

4. 加样步骤

在ELISA中，通常需要进行三次加样：添加标本、加酶结合物和添加底物。加样时应确保样本落于板孔底部，避免液体接触孔壁并产生气泡。通常使用微量加样器进行精确加样，并更换吸嘴以防交叉污染。若需要稀释血清，建议在试管中按规定比例稀释后再进行加样。加酶结合物和底物时可使用定量多道加液器，提高加液效率。

5. 保温步骤

在ELISA中进行抗原和抗体反应时，需要保持特定的温度和时间，此过程称为温育。ELISA是固相免疫测定，抗原和抗体的结合主要发生在固相表面。例如在夹心法中，标本中的抗原并不是均匀接触固相抗体，而是需要通过扩散达到反应平衡。一般而言，37℃是最常用的温育温度，适合大多数抗原抗体结合。如果需要加速反应，可以考虑提高温度，但不建议超过43℃。在某些情况下，为了得到更彻底的反应结果，抗原抗体反应可在4℃下进行，不过在ELISA中通常不推荐采用过长的反应时间。

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