在之前的文章中，我们探讨了慢病毒如何有效整合外源基因于宿主染色体，实现长期表达，同时也提到慢病毒可以感染几乎所有类型的哺乳动物细胞、干细胞以及原代细胞。由于其多种优势，慢病毒已成为强大而有效的基因传递工具，广泛应用于生物医学领域。那么，当我们成功获得包装好的慢病毒后，接下来应该如何进行实验操作呢？接下来，将为大家详细介绍操作步骤，确保获取到有价值的信息。

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装并储存在-80℃的冰箱中，保存期限为半年。若超过这一时限，使用前需重新测定病毒滴度。短期实验（3-5天）时可以将病毒置于4℃保存。尽量避免病毒的反复冻融，这样会降低病毒的滴度。可根据每次实验所需的量进行合理分装。

2. 病毒的稀释

如需对病毒进行稀释，首先应将冻存的病毒冰浴融化，然后使用PBS或无血清培养基进行稀释并混匀，保持在4℃保存。为保证病毒的滴度，最好在3天内使用完毕。

3. 预实验确定MOI

由于不同细胞对慢病毒的感染敏感性存在差异，因此在正式实验前需通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数（MOI）及最佳感染条件。这包括接种的细胞量、感染时的总体积和换液时机，以确保实验效果最佳。

感染预实验步骤如下：

第1天，将生长状态良好的细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5% CO₂培养箱培养过夜。第2天，根据实验需要设置梯度MOI（一般为3-100），根据假设的病毒滴度计算每孔所需加入的病毒原液量。并配置病毒稀释液确保每孔的最终体系为100µL。在这一过程中，可以设计含有Polybrene的实验组与对照组（Blank组）。

第3天，更换培养液，通常在病毒感染16-24小时后进行。第4-5天，利用倒置荧光显微镜观察48-72小时后的感染效率，并确定合适的MOI值用于真正的实验。

4. 慢病毒感染目标细胞

当预实验确认了MOI值后，即可进行正式的感染实验。以使用含有GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒为例，具体操作如下：

• 第一天，按实验需要将细胞铺板，24孔板的细胞副本一般为5-10×10⁴ cells/孔，培养过夜至细胞密度约50%。
• 第二天，从-80℃冰箱取出病毒，冰浴融化后按预实验得到的MOI值稀释病毒。注意轻轻混匀，避免使用振荡器。
• 吸去细胞原有培养基，将稀释的病毒液加入细胞中，并根据预实验确定是否添加Polybrene。感染后继续在37℃培养过夜。
• 16-24小时后，吸去含病毒的培养基，换成新鲜培养基。
• 继续培养48-72小时后，收集细胞以检测目的蛋白的表达。

5. 目的细胞稳转株的构建

成功感染细胞后，感染细胞能够在含有特定浓度抗生素的培养基中存活，而未感染细胞则会死亡。通过这种抗性筛选，可以成功筛选出稳定表达目的基因的细胞株。经过抗生素筛选后，应定期更换含抗生素的培养液，直到对照组细胞观察到死亡，而感染组细胞则保持存活。

对于稳转株的构建及保存：

• 多克隆稳转株筛选：将抗生素浓度降低至维持浓度，并继续筛选感染后的细胞，收集以进行鉴定。
• 单克隆稳转株筛选：将感染细胞稀释，并挑取单个细胞进行扩增，以得到形态均一、表达稳定的细胞株。

不同细胞依赖性可能存在差异，建议进行单克隆预实验确认细胞的增殖能力。

通过这些步骤，您将能够更有效地利用慢病毒技术进行基因传递，推动生物医学研究的进展。坚持使用尊龙凯时人生就博，将为您提供更专业的技术支持和优质的服务，助力您的科研之路！